液氮罐内体细胞的冻存和再生原理是什么？

　　一、基本原理 在不用一切标准下立即冻存体细胞时，体细胞内和外自然环境中的水都是产生冰晶，能造成体细胞内产生机械设备损害、电解质溶液上升、血浆渗透压更改、脱干、PH更改、蛋白质转性等，能造成体细胞身亡。如向细胞培养液添加保护膜，可让冰度减少。

　　在迟缓的冻洁标准下，能使体细胞内水分在冻洁前显出体细胞。存储在-130℃下列的超低温里能降低冰晶的产生。 体细胞再生时速率要快，使之快速根据体细胞容易损伤的-5～0℃，体细胞仍能生长发育，魅力损伤并不大。 现阶段常见的保护膜为二甲亚砜(DMSO)和凡士林，他们对体细胞不含毒性，含量小，溶解性大，易透过体细胞。

　　二、操作流程 (一)冻存

　　1、消化吸收体细胞(同试验二)，将体细胞悬浮液搜集至离心管中。

　　2、1000rpm抽滤10分鐘，弃上清液。

　　3、沉定加含维护液的塑造，记数，调节至5×106/ml上下。

　　4、将悬液分至冻银行存管中，每管1ml。

　　5、将冻银行存管口封严。如用安瓿瓶则火苗密封，密封一定要严，不然再生*易出現崩裂。

　　6、贴标签，注明体细胞类型，冻存时间。冻银行存管外拴一金属材料吊物和一轻绳。

　　7、按以下次序减温：室内温度→4℃(20分鐘〕→电冰箱冷藏室(30分鐘)→低温箱(-30℃1钟头)→汽态氮(30分鐘)→液态氮。 留意：实际操作时要当心，以防液态氮冻伤。液态氮定期维护，随时随地填补，絕對不可以蒸发整洁，一般30立升的液态氮可用1～1.5月。

　　(二)再生

　　1、提前准备一个茶缸或1000ml的烧毁，内窗2/3杯37℃的温开水。

　　2、从液态氮中取下冻银行存管、快速放置温开水中并持续搅拌。使冻银行存管中的冻存物在1分鐘以内溶化。 3、开启冻银行存管，将体细胞悬浮液吸进离心管中。

　　4、1000rpm抽滤10分鐘，弃去上清液。

　　5、沉定加10ml细胞培养液，吹打匀称，再抽滤10分鐘，弃上清液。

　　6、加适度培养液后将体细胞迁移至塑造瓶中，37℃塑造，第二天观查生长发育状况。

　　三、实验试剂和器械 器械：液氮罐、冻银行存管(塑胶螺旋灯专用型冻银行存管或安瓿瓶)、离心管、塑料吸管、离心脱水机等 实验试剂：0.25%胰酶、培养液、含保护膜的培养液(即冻存液) 附：冻存液配置： 培养液添加凡士林或DSMO，使其终浓度值达5—20%。保护膜的类型和使用量视不一样体细胞而不一样。选好后4℃下储存。